侵袭性真菌靶向测序
蒸湘区万核医学基因检测咨询中心是滨州市惠民县专业侵袭性真菌靶向测序预约机构，位于衡阳市蒸湘区船山大道65号（如需办理，需提前预约），预约电话4001789498。为珠晖区、雁峰区、石鼓区等地患者提供精准病原微生物检测服务。
1. 项目介绍
蒸湘区万核医学基因检测咨询中心提供专业的侵袭性真菌靶向测序检测服务。预约电话：400-178-9498
在病原微生物诊断领域，基于二代测序（NGS）的宏基因组学技术（mNGS）带来了革命性突破。它能在24-48小时内，无需预设地对样本中数千种细菌、病毒、真菌及寄生虫等病原体进行“一网打尽”式筛查。然而，面对复杂临床样本中极高比例的人源背景核酸，mNGS对于低载量病原体，尤其是真菌的检测灵敏度面临挑战。在此背景下，侵袭性真菌靶向测序应运而生。该技术基于多重PCR与NGS结合，通过对特定靶标区域进行深度富集，极大提升了目标真菌的检测灵敏度与特异性，为临床快速、精准诊断侵袭性真菌感染（IFI）提供了强有力的新工具。
侵袭性真菌感染的诊治在中国面临严峻挑战。我国是结核病负担大国，患者数量位居全球第三，而结核病及其治疗常导致免疫受损，是真菌感染的高危因素。重症监护病房（ICU）内医院获得性感染率高达15-30%，其中真菌感染是导致患者死亡率增加的重要原因。与此同时，细菌与真菌的耐药性问题日益突出，耐药菌检出率持续增长，使得经验性抗感染治疗失败风险增高。在社区获得性肺炎及高死亡率的脓毒症患者中，真菌感染也占有相当比例，但其病原学诊断常因传统方法（如培养、镜检）阳性率低、周期长而延误。因此，亟需一种快速、精准的检测手段，以应对当前严峻的感染性疾病诊疗形势。
2. 检测内容
本检测项目针对临床常见的侵袭性真菌进行精准靶向测序，检测范围涵盖76种关键病原真菌，并具有优异的分析性能。
注：本检测同时可对部分真菌相关的关键耐药基因（如唑类耐药相关的CYP51A基因突变）进行检测，为临床用药提供参考。
3. 技术原理
侵袭性真菌靶向测序采用“多重PCR富集+二代测序”的技术路径，其核心流程如下：
- 样本处理与核酸提取： 根据不同样本类型（如血液、肺泡灌洗液、组织等）进行前处理，采用优化的裂解方案高效释放病原体，并提取总核酸（包括DNA和/或RNA），最大限度去除宿主背景及抑制物。
- 多重PCR靶向富集： 针对76种目标真菌高度保守且具鉴别意义的基因区域（如ITS， 18S/28S rDNA， D1/D2区，特定功能基因等），设计特异性引物池进行多重PCR扩增。此步骤可特异性富集痕量真菌核酸，显著提升其在测序文库中的比例。
- 测序文库构建与上机测序： 将富集后的PCR产物进行纯化，并连接测序接头，构建成适用于二代测序平台的文库。随后在高通量测序仪上进行双端测序，产生海量序列数据。
- 生物信息学分析： 对下机数据进行质控、去宿主、去冗余后，将高质量序列与经过严格校验的真菌专用数据库进行比对。通过算法分析，实现种级别甚至亚型的精准鉴定，并生成包含病原体列表、序列数、相对丰度等信息的分析报告。
4. 适用人群
本检测适用于高度怀疑侵袭性真菌感染，但传统微生物学检查阴性或无法明确病原体种类的患者，尤其推荐以下人群：
- ICU重症患者： 存在呼吸机相关性肺炎、血流感染、脓毒症等，且广谱抗生素治疗无效，病情危重需快速明确病原。
- 不明原因发热患者： 尤其是长期发热，伴有免疫抑制基础病，经初步检查未能明确感染源者。
- 免疫低下或缺陷患者： 包括血液系统恶性肿瘤、实体器官或造血干细胞移植后、长期使用糖皮质激素或免疫抑制剂、艾滋病患者等。
- 抗感染治疗失败患者： 经验性抗真菌治疗（如棘白菌素、唑类）后临床反应不佳，需明确是否存在耐药或非目标真菌感染。
- 特殊部位疑似真菌感染者： 如中枢神经系统感染、骨关节感染、深部脓肿、播散性感染等，常规取材困难或培养阳性率极低。
5. 样本采集与送检
规范的样本采集、保存与运输是保证检测准确性的前提。以下为常见样本类型的操作规范：
- 外周血： 使用无菌血培养瓶或专用游离DNA采血管，严格无菌操作采集。建议在寒战、发热初期或使用抗真菌药物前采集。采集后室温保存，尽快送检。
- 肺泡灌洗液（BALF）： 由临床医生在支气管镜下无菌操作获取，通常需要5-10毫升。置于无菌螺旋盖痰液收集器或无菌容器中，立即送检或短期冷藏保存。
- 脑脊液、胸水、腹水、关节液： 无菌穿刺采集，建议量不少于1毫升。置于无菌螺旋盖容器中，避免污染，尽快送检。
- 痰液： 留取深部晨痰，置于无菌痰液收集器中。应尽快送检，避免长时间室温放置。
- 新鲜组织或脓肿穿刺液： 手术或穿刺获取，组织样本应置于无菌生理盐水湿润的无菌容器中，避免使用福尔马林固定。脓肿液置于无菌容器。均需尽快送检。
- 骨髓、尿液： 无菌操作采集，置于相应无菌容器中，尽快送检。
通用原则： 所有样本应在采集后尽快送检。若运输时间可能超过规定时限，需参照具体样本的保存条件（通常为2-8℃冷藏）进行暂存。运输需使用生物安全包装，并附有完整的检测申请单。
6. 抗感染监测
侵袭性真菌靶向测序不仅可用于初始诊断，也可作为抗感染治疗过程中的有效监测工具。
- 疗效评估时机： 对于确诊IFI并启动靶向治疗的患者，可在治疗开始后一段时间（例如7-14天，或根据临床需要）进行复查。通过对比治疗前后目标病原体的序列数变化，辅助评估治疗应答情况。序列数显著下降或转阴常提示治疗有效。
- 复检指征： 初始治疗后临床症状、体征无改善甚至恶化；影像学提示感染病灶进展；患者免疫状态发生重大变化（如更强的免疫抑制）；初始检测为混合感染，需评估不同病原体动态。
- 耐药监测： 本检测可同步分析特定耐药基因。若治疗过程中检测到与当前用药种类相关的耐药基因突变，或初始敏感菌在治疗压力下出现新的耐药突变，可为临床及时调整抗真菌方案提供分子依据。
7. 报告解读
临床医生在解读报告时，需结合患者临床表现、影像学、其他实验室检查及流行病学史进行综合判断。
- 阳性阈值与意义： 报告会提供检测到的真菌种类及其序列数。序列数的高低与样本中病原体载量相关，但并非绝对等同于临床感染程度。对于无菌部位样本（如血液、脑脊液、组织），即使序列数不高，其阳性结果也具有很强的临床意义。对于呼吸道样本（如BALF、痰），需谨慎区分定植与感染，高序列数或动态上升趋势支持感染诊断。
- 混合感染： 本检测可能发现两种或以上真菌，或真菌与细菌、病毒混合存在的情况。需根据各病原体的序列数、已知致病性及临床背景，判断主要致病菌与协同感染菌。
- 耐药基因报告： 报告中若提示检出特定耐药基因突变（如烟曲霉的TR34/L98H CYP51A突变，提示对唑类药物耐药），强烈建议临床考虑该耐药表型的可能性，并参考相关指南选择替代药物。但需注意，基因型与表型并非完全一致，有条件时应结合药敏试验。
- 阴性结果解读： 阴性结果不能完全排除真菌感染，可能原因包括：病原体载量低于检测限、样本采集前已使用强效抗真菌药物、病原体不在本检测 panel 覆盖范围内、或样本采集不规范。对于临床高度怀疑者，可考虑重复送检或结合其他诊断方法。
总之，侵袭性真菌靶向测序是传统微生物诊断技术的重要补充和升级，以其快速、精准、覆盖面广的优势，正成为重症感染、免疫缺陷患者合并真菌感染诊断与管理的利器。临床应用中，应始终秉持“病原学证据结合临床”的原则，使该技术最大程度地服务于精准抗感染治疗。
